Kultivierung mariner Bakterien der SAR202-Klade

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 5098 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Bakterien der SAR202-Klade innerhalb des Stammes Chloroflexota sind im Ozean allgegenwärtig verbreitet, wurden jedoch noch nicht im Labor kultiviert. Es wurde vermutet, dass alte Erweiterungen katabolischer Enzymparaloge das Spektrum organischer Verbindungen erweiterten, die SAR202-Bakterien oxidieren konnten, was zu Veränderungen im Kohlenstoffkreislauf der Erde führte. Hier berichten wir über die erfolgreiche Kultivierung von SAR202-Bakterien aus Oberflächenmeerwasser mittels Verdünnungs-bis-Aussterben-Kultivierung. Das Wachstum dieser Stämme ist sehr langsam (0,18–0,24 Tag−1) und wird durch Lichteinwirkung gehemmt. Die Genome von ca. 3,08 Mbit/s, kodieren Archaella (archaeale Motilitätsstrukturen) und mehrere Sätze von Enzymparalogen, darunter 80 Gene, die für Enzyme der Enolase-Superfamilie kodieren, und 44 Gene, die NAD(P)-abhängige Dehydrogenasen kodieren. Wir schlagen vor, dass diese Enzymparaloge an mehreren parallelen Wegen des nichtphosphorylierenden Katabolismus von Zuckern und Zuckersäuren beteiligt sind. Tatsächlich zeigen wir, dass SAR202-Stämme mehrere Substrate nutzen können, die über die vorhergesagten Wege metabolisiert werden, wie z. B. die Zucker ʟ-Fucose und ʟ-Rhamnose sowie deren Lacton- und Säureformen.

Die SAR202-Klade im Stamm Chloroflexota ist im Ozean allgegenwärtig verbreitet und macht 10–30 % der planktonischen Prokaryoten in der Tiefsee aus1,2,3,4,5,6,7. Verschiedene Eigenschaften im Zusammenhang mit der Organoheterotropie sowie dem Schwefel- und Stickstoffstoffwechsel wurden anhand von SAR202-Metagenomanordnungen und Einzelzellgenomsequenzen interpretiert6,8,9,10,11,12. Die sieben Gruppen (Unterklassen) von SAR202 unterscheiden sich individuell in der Anzahl und Art der darin enthaltenen Paralogs8,12, was auf einen Zusammenhang zwischen der Paralogentwicklung und der Nischenspezialisierung der Unterklassen schließen lässt.

Paraloge Flavin-abhängige Monooxygenase-Gene in Gruppe III SAR202, in einigen Fällen mehr als 100 pro Genom, sollen sich entwickelt haben, um Kohlenstoff und Energie aus verschiedenen organischen Molekülen zu gewinnen, die sich während der Ausdehnung des Kohlenstoffkreislaufs der Erde nach dem Anstieg in den Ozeanen angesammelt haben der sauerstoffhaltigen Phototrophie8,12,13. In ähnlicher Weise wird angenommen, dass sich in Gruppe I SAR202 große Erweiterungen von Paralogs in der Enolase-Protein-Superfamilie entwickelt haben, um diesen Zellen die Metabolisierung von Verbindungen zu ermöglichen, die aufgrund ihrer chiralen Komplexität einer biologischen Oxidation widerstehen. Die frühe Verzweigung dieser Paralogs in phylogenetischen Bäumen weist darauf hin, dass die Evolution der SAR202-Zellen ein entscheidender Faktor für ihre Diversifizierung war8,12,13.

SAR202-Zellen kommen in den gesamten Wassersäulen des Ozeans vor und erreichen die höchste Zahl nahe der Meeresoberfläche, sie machen jedoch einen höheren Prozentsatz aller Planktonzellen im Meso-, Bathy-, Hadal- und Abyssopelagium aus5,10,12. SAR202 der Gruppen I und II haben Rhodopsin-Gene in ihren Genomen und sind die am häufigsten vorkommenden SAR202 in epipelagischen Umgebungen, während Gruppe III, denen Rhodopsin-Gene fehlen, größtenteils für die hohe relative Häufigkeit von SAR202 im dunklen Ozean verantwortlich ist.

Die Kultivierung nicht repräsentierter Zelltypen hat für Mikrobiologen Priorität, da Zellen häufig Eigenschaften aufweisen, die sich anhand ihres Genoms nicht einfach vorhersagen lassen14. Eine aktuelle Studie hat gezeigt, dass genombasierte Schlussfolgerungen die Katabolisierungswege für mehr als 50 % der Kohlenstoffquellen, die von verschiedenen Prokaryoten genutzt werden und über gut kuratierte phänotypische Daten verfügen, nicht zuverlässig vorhersagen können15. Trotz des jüngsten Anstiegs des Interesses und der technologischen Fortschritte bei der Kultivierung bleibt ein großer Teil der prokaryotischen Gruppen unkultiviert16. Für die SAR202-Klade gibt es noch keine kultivierten Isolate, was sie zu einer der „meistgesuchten“ Kulturen und einem wichtigen „Ziel für die Kultivierung“ macht14,17.

Hier berichten wir über die erfolgreiche Kultivierung von SAR202-Bakterien. Vierundzwanzig Isolate der Subklasse I wurden aus Oberflächenmeerwasserproben durch Verdünnung bis zur Extinktion in sterilen Meerwassermedien gewonnen. Die durch experimentelle Daten mit Zellen gestützte Stoffwechselrekonstruktion implizierte Enolase- und Dehydrogenase-Paralogs bei der nicht-phosphorylierenden Zuckeroxidation. Wir schlagen vor, dass mehrere parallele Stoffwechselwege dieser Art es diesen Zellen ermöglichen, komplexe Mischungen zuckerbezogener Verbindungen aus gelösten organischen Kohlenstoffpools zu gewinnen. SAR202, die in der gesamten Wassersäule moderner Ozeane vorkommen, entwickelte sich gleichzeitig mit dem Aufstieg der sauerstoffhaltigen Phototrophie13. Wir schlagen vor, dass sie sich auf die Nische der Ernte verdünnter und verschiedener kohlenhydratbezogener Moleküle ausgeweitet haben, wenn die Ozeane oxidiert werden.

Experimente zur Verdünnung bis zur Extinktion mit nährstoffarmen heterotrophen Medien (LNHM; Ergänzungstabelle 1) in Mikrotiterschalen ergaben vierundzwanzig SAR202-Isolate der Gruppe I aus Oberflächenproben (Tiefe 10 m) von zwei Stationen (GR1 und GR3) in der Nähe von Garorim Bucht des Gelben Meeres (Ergänzende Abbildung 1a). Vier Bedingungen, die sich durch Katalase-Zugabe und Lichteinwirkung unterschieden (kontinuierliche Dunkelheit vs. 14:10-stündiger Hell-Dunkel-Zyklus), ergaben 610 Stämme, von denen 24 zur SAR202-Gruppe gehörten (Ergänzungstabelle 2). Alle 24 SAR202-Stämme wurden aus Kulturen erhalten, die kontinuierlich im Dunkeln inkubiert wurden (Ergänzungstabelle 2).

Phylogenetische Vergleiche zeigten, dass die Isolate nahezu identische 16S-rRNA-Gensequenzen aufwiesen, mit der SAR202-Gruppe I (Abb. 1a)3,8,12 assoziiert waren und der Haupt-Amplikonsequenzvariante (ASV) (mehr als 68 %) der Isolate entsprachen SAR202-Klade (0,7–1,0 % der gesamten Prokaryoten) in den Wasserproben (ergänzende Abbildung 2).

ein phylogenetischer Baum basierend auf 16S-rRNA-Gensequenzen, der die Beziehung zwischen den 24 in dieser Studie isolierten SAR202-Stämmen und eng verwandten Sequenzen zeigt, die aus verschiedenen Datenbanken abgerufen wurden, darunter GTDB (violett markiert), IMG (gelb), GenBank und EzBioCloud. Die vier für die Genomsequenzierung ausgewählten SAR202-Stämme sind rot markiert. RAxML (v8.2.12) wurde für die Baumbildung mit dem GTRGAMMA-Modell verwendet. Angegeben sind Bootstrap-Unterstützungswerte (≥70 %; aus 100 Resamplings). Dehalococcoides mccarty wurde als Außengruppe festgelegt. Balken, 0,1 Substitutionen pro Nukleotidposition. b Phylogenomischer Baum der SAR202-Klade. Die vier Genome der SAR202-Stämme aus dieser Studie (rot markiert) und anderer MAGs und SAGs aus früheren Studien wurden mithilfe von GTDB-Tk klassifiziert. Für die Baumbildung wurden artenclusterrepräsentative Genome der GTDB-Taxa einbezogen, in die die analysierten SAR202-Genome klassifiziert wurden. Die Bezeichnung der SAR202-Untergruppen nach dem Klassifizierungsschema einer früheren Studie12 ist auf der linken Seite des Baums mit Farbschattierungen angegeben. Auf der rechten Seite des Baums ist die taxonomische Zuordnung der Genome auf Familien- und Ordnungsebene gemäß GTDB (Release 202) dargestellt. Der Baumaufbau wurde mit RAxML (v8.2.12) mit der Option PROTGAMMAAUTO durchgeführt, basierend auf einem verketteten Alignment von Kerngenen, das durch die UBCG-Pipeline erhalten wurde. Auf den Knoten sind Bootstrap-Unterstützungswerte (100 Iterationen) angegeben. Balken, 0,1 Substitution pro Aminosäureposition.

Vier für weitere Experimente ausgewählte Stämme, JH545, JH702, JH639 und JH1073, verhielten sich ähnlich, wuchsen langsam (0,18–0,24 Tag−1) und zeigten Lichtempfindlichkeit (Abb. 2a–c). Der Stamm JH545 wuchs optimal bei 15–20 °C (ergänzende Abbildung 3), weshalb alle nachfolgenden Experimente bei 20 °C durchgeführt wurden. Es waren etwa 50 Tage erforderlich, um die stationäre Phase bei maximalen Zelldichten von ~2 × 108 Zellen ml−1 zu erreichen (Abb. 2a). Ein sehr geringes Wachstum, gefolgt von einem allmählichen Rückgang bei 4 °C (ergänzende Abbildung 3), deutet darauf hin, dass der Stamm JH545, der zur SAR202-Gruppe I gehört, möglicherweise nicht gut an die Tiefsee angepasst ist, wo andere Mitglieder der SAR202-Gruppe (z. B. Gruppe III) sind weit verbreitet12.

a Anfängliche Wachstumskurven von vier repräsentativen SAR202-Stämmen in heterotrophem Medium mit niedrigem Nährstoffgehalt (LNHM) unter dunklen Bedingungen. b Wachstumskurven der vier Stämme unter kontinuierlichen Dunkel- und Hell-Dunkel-Bedingungen in LNHM. Der Hell-Dunkel-Zyklus (14:10 h) wurde mit LED-Lampen mit einer Lichtintensität von ~155 μmol Photonen m–2 s–1 angewendet. Für den dunklen Zustand wurden die Röhrchen in Aluminiumfolie eingewickelt. c Wachstumskurven des Stammes JH545 unter dunklen Bedingungen und verschiedenen Lichtintensitäten in LNHM5x. Alle Kulturen wurden zunächst im Dunkeln inkubiert (dh die Röhrchen wurden in Aluminiumfolie eingewickelt). An dem durch einen schwarzen Pfeil angezeigten Tag wurden einige Kulturen in den Lichtzustand versetzt (dh die Aluminiumfolie wurde entfernt) und Licht mit den folgenden Intensitäten ausgesetzt: WL, ~45; ML, ~89; SL, ~134 μmol Photonen m–2 s–1. Das Experiment in c wurde dreifach durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwerte ± SEM dargestellt. Beachten Sie, dass die Fehlerbalken ausgeblendet werden, wenn sie kürzer als die Größe der Symbole sind. a–c Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. d–f Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Zellen des Stamms JH545, beobachtet mit TEM (d), Dünnschnitt-TEM (e) und REM (f). Maßstabsbalken, 100 nm.

Das Wachstum aller vier Stämme wurde durch Hell-Dunkel-Zyklen mit Breitspektrum-LED-Lichtern gehemmt (Abb. 2b), und Experimente mit dem Stamm JH545 zeigten, dass eine kontinuierliche Lichteinwirkung bei allen getesteten Lichtintensitäten (~45) zu einer Wachstumshemmung und anschließendem Zelltod führte –134 μmol Photonen m−2 s−1), mit Variationen in den Antwortniveaus (Abb. 2c).

Obwohl es sich bei den Isolaten um Reinkulturen handelte, zeigten die TEM- und SEM-Mikroskopie kurze Stäbchen (~0,8 × 0,4 μm), Kokken (Durchmesser ~0,5 μm), Scheiben und Scheiben mit bikonkaven Zentren, die manchmal toroidförmig zu sein schienen, wie für die Stämme berichtet von Dehalococcoides18,19, einer Gattung, die zur gleichen Klasse (Dehalococcoidia) wie SAR202 gehört (Abb. 2d – f und ergänzende Abb. 4). Dünnschnitt-TEM-Bilder zeigten monodermale Zellhüllen, ähnlich denen anderer Chloroflexota (Abb. 2e)20,21.

Die Genome der vier SAR202-Stämme hatten eine Länge von 3083–3094 kb mit einem GC-Gehalt von 51,8 %, einer Kodierungsdichte von ~87,5 % und einer durchschnittlichen Nukleotididentität (ANI) zwischen den Stämmen von mindestens 99,9 %. Die beiden auf der PacBio-Plattform sequenzierten Genome (JH545 und JH1073) wurden zu einem kreisförmig geschlossenen Contig zusammengesetzt, während die anderen beiden mit der Illumina-Technologie sequenzierten Genome aus mehr als 30 Contigs bestanden (~846 kb N50 für beide Genome) (ergänzende Abb. 5c). Die kreisförmige Karte des JH545-Genoms zeigte mehrere Regionen mit anomalem GC-Gehalt und GC-Versatz (ergänzende Abbildung 5a), von denen viele mit den vorhergesagten genomischen Inseln überlappten (ergänzende Abbildung 5b).

Die vom Genom abgeleiteten Stoffwechselmerkmale waren bei den vier Genomen nahezu identisch (z. B. COG-Profile; Ergänzungstabelle 3), was uns dazu veranlasste, uns zur weiteren Analyse auf eines davon, JH545, zu konzentrieren (Abb. 3). In Übereinstimmung mit früheren Studien deutete die Annotation des Genoms auf einen zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel hin, der für aerobe Organoheterotrophe typisch ist, wobei einige Gene auf Kapazitäten für Lithotrophie durch Sulfidoxidation (Sulfid:Chinonoxidoreduktase) und anaerobe Atmung durch Nitratreduktion (NapAB) und N2O-Reduktion (NosZ) hinweisen ) (Ergänzende Anmerkungen). Das Vorhandensein von NapAB und NosZ wurde in den SAR202-MAGs berichtet, die aus der „toten Zone“ im nördlichen Golf von Mexiko gewonnen wurden, wo die Expression dieser Gene in den Proben mit dem niedrigsten gelösten Sauerstoff nachgewiesen wurde9. In Übereinstimmung mit früheren Genomanalysen von Dehalococcoidia-Mitgliedern19,22,23 wurde die Peptidoglycan-Biosynthese nicht in den SAR202-Genomen kodiert. Die TEM-Bilder zeigten eine Schicht außerhalb der Zellmembran von JH545 (Abb. 2d, e), die an die S-Schicht erinnert, die bei Dehalococcoidia-Stämmen ohne Peptidoglycan beobachtet wird24,25.

Einige wichtige Stoffwechselwege sind durch blaue Kästchen gekennzeichnet. Detaillierte Informationen zu den Enzymen, die den Zahlen neben den Pfeilen entsprechen, finden Sie in den Zusatzdaten 1. Die Farben der Transporter unten geben Funktionskategorien an: Rosa, ABC-Transporter; blau, andere. Abbildung erstellt mit BioRender.com.

Gesamtgenom-Phylogenien der Genome Taxonomy Database (GTDB) weisen darauf hin, dass die von uns kultivierten SAR202-Zellen der Gruppe I Isolate einer bisher nicht kultivierten Ordnung (UBA1151) innerhalb einer monophyletischen Überordnung darstellen, die alle SAR202 umfasst (Abb. 1b und ergänzende Anmerkungen). Wir schlagen den vorläufigen taxonomischen Namen „Candidatus Lucifugimonas Marina“ vor, der neben dem Stamm JH545 als Typusstamm auch die Stämme JH639, JH702 und JH1073 umfasst. Um dieser neuen Gattung und Art gerecht zu werden, schlagen wir auch die Familie „Candidatus Lucifugimonadaceae“ vor. Nov. und die neue Ordnung „Candidatus Lucifugimonadales“ ord. Nov. innerhalb der Klasse Dehalococcoidia (siehe Abschnitt Methoden).

In den vier SAR202-Genomen wurde ein Gencluster für Archaellum, eine archaeale Motilitätsstruktur, vorhergesagt. Dieser Gencluster ähnelt den in Archaeen beobachteten konservierten Anordnungen von Archaellum-Genen 26, 27 und umfasst sechs Tandemkopien von flaB (kodierend für Archaellin), gefolgt von den Genen flaGFHIJ (ergänzende Abbildung 6). Sechs zusätzliche Kopien der flaB-Gene waren über das Genom verteilt. Ein Kandidatengen für FlaK, eine Familie von Prepilin-Peptidasen, die Signalpeptide aus Archaellin entfernen26, wurde ebenfalls basierend auf der Zuordnung zu COG1989 und dem Vorhandensein der Domäne PF01478 (Peptidase_A24; Typ-IV-Leader-Peptidase-Familie) vorhergesagt28.

Archaellen sind mit Pili vom Typ IV verwandt und haben keine evolutionäre Beziehung zu bakteriellen Flagellen. Obwohl zuvor berichtet wurde, dass ein Chloroflexota-MAG aus Grundwasserleitersedimenten einen Gencluster für Archaellum enthält29, wurde nie berichtet, dass Bakterienisolate Archaella beherbergen. Die Suche nach FlaB-Homologen in der IMG-Datenbank ergab, dass zwei SAR202-MAGs aus dem Golf von Mexiko Archaellum-Gencluster aufwiesen, die denen von JH545 sehr ähnlich waren (ergänzende Abbildung 6)9. Die Untersuchung der Verteilung von FlaB (K07325) mithilfe der AnnoTree-Datenbank zeigte, dass die meisten (45 von 52) Bakteriengenome, die flaB enthielten, mit Chloroflexota assoziiert waren. Die verbleibenden sieben Bakteriengenome mit flaB waren auf sieben Phyla verteilt, was darauf hindeutet, dass dieses Gen unter anderen Bakterien sehr selten ist. Von den 45 flaB-beherbergenden Chloroflexota-Genomen gehörten 40 zu den 212 Dehalococcoidia-Genomen in der Datenbank, und die restlichen 5 befanden sich in Anaerolineae. Diese Verteilung legt nahe, dass Archaella-Gene möglicherweise von Archaea auf einen Vorfahren von Chloroflexota übertragen und in der Klasse Dehalococcoidia erhalten geblieben sind. Eine phylogenetische Analyse der FlaB-Sequenzen, die im Stamm JH545, mehreren Chloroflexota-Genomen und repräsentativen Archaeen-Isolaten gefunden wurden, bestätigte diese Schlussfolgerung. Die FlaB-Sequenzen von Chloroflexota bildeten eine monophyletische Gruppe, die als Schwestergruppe einer archaischen FlaB-Gruppe lokalisiert wurde (ergänzende Abbildung 7). Die Untersuchung der 45 Chloroflexota-Genome mit FlaB (gefunden in AnnoTree) und BlastP-Suchen bei NCBI (FlaB des Stamms JH545 als Abfrage) ergab, dass mindestens zwei Chloroflexota-Stämme kultiviert wurden, die einen Archaella-Gencluster (flaB und mehrere andere Gene) beherbergen: Litorilinea aerophila30,31 und Aggregatilinea lenta32 (Ergänzende Abbildung 6). Bei der mikroskopischen Untersuchung der SAR202-Zellen wurden keine Archaellen beobachtet.

Im JH545-Genom wurden zwei Kopien der Heliorhodopsin (HeR)-Gene nachgewiesen. In einer aktuellen Studie über marine SAR202 MAG/SAGs wurden Rhodopsin-Gene in 28 Genomen der Gruppen I und II gefunden, die alle aus Wassertiefen von weniger als 150 m entnommen wurden. In einem einzelnen Gruppe-II-Genom wurde über ein HeR-Gen berichtet12. Daher stellt dieser Befund das Vorhandensein von HeR in SAR202-Gruppe I dar. Die beiden im JH545-Genom gefundenen HeR-Kopien wiesen eine Aminosäureidentität von ~83 % auf und befanden sich ein Gen stromabwärts der DNA-Photolyase, die durch UV-Exposition verursachte DNA-Schäden mit sichtbarem Licht repariert Licht (Ergänzende Abb. 8a). Das Alignment mehrerer Sequenzen zeigte, dass sich die beiden Kopien im Aminosäurerest unterschieden, der in einer Ala-Scanning-Mutagenesestudie33 zu einer spektralen Verschiebung führte (W163 in 48C12; ergänzende Abbildung 8b), was darauf hindeutet, dass die beiden HeR-Kopien möglicherweise unterschiedliche Absorptionsspektren aufweisen. Obwohl die Funktion von HeR noch ungeklärt ist, wurde kürzlich vermutet, dass es als Lichtsensor fungieren könnte, der Reaktionen auf lichtinduzierten oxidativen Stress reguliert34,35. Da in der SAR202-Gruppe III, die im dunklen Ozean häufig vorkommt, kein HeR gefunden wurde12, könnte der Besitz von HeR durch aus Küstenoberflächenwasser isoliertes JH545 ein Hinweis auf eine Anpassung an den euphotischen Lebensraum sein.

In Übereinstimmung mit einer früheren Studie9 wurde im JH545-Genom eine große Anzahl von Transportern der Major Facilitator Superfamily (MFS) gefunden, darunter 42 Proteine, die COG0477 zugeordnet sind (Ergänzungstabelle 3). MFS ist eine sehr große Familie von Membrantransportern, von denen bekannt ist, dass sie eine Vielzahl von Verbindungen transportieren, darunter Mono- und Oligosaccharide, Aminosäuren und Nukleoside36,37. Es ist bemerkenswert, dass einige Substrate, über die wir unten berichten, das Wachstum von JH545 fördern (siehe den nächsten Abschnitt zu COG4948) und bekanntermaßen von MFS-Proteinen transportiert werden38,39,40.

Achtzehn Proteine ​​im JH545-Genom wurden COG3119 zugeordnet und als Arylsulfatase A oder ein verwandtes Enzym bezeichnet (Ergänzungstabelle 3). Über Sulfatase-Paralogs wurde bereits in den SAR202-Gruppen I und II12 berichtet. Arylsulfatasen katalysieren die Desulfatierung sulfatierter Kohlenhydrate auf einigen katabolen Wegen, beispielsweise dem Abbauweg von Ulvan durch ein Meeresbakterium41.

Wir berichten, dass die Genome von kultiviertem SAR202 80 COG4948-Proteine ​​in der Mandelat-Racemase-Familie innerhalb der Enolase-Superfamilie kodierten (~2,8 % der CDS; Ergänzungstabelle 3). Viele Meeresbakterien haben minimale Genome mit wenigen Paralogs, sodass die ungewöhnlich großen Sätze von Paralogs, die in verschiedenen SAR202-Gruppen vorhanden sind, wie COG4948 und COG2141 in den Gruppen I bzw. III, bei ihrer ersten Entdeckung Aufmerksamkeit erregten12.

Wir wollten herausfinden, ob die Expansion von COG4948 in SAR202-Gruppe I im Kontext der prokaryotischen Diversität ungewöhnlich ist. Wir haben die Genome in GTDB analysiert, einer der phylogenetisch umfassendsten Genomdatenbanken. Da die COG-Annotation nicht skalierbar ist, haben wir die Anzahl der beiden Pfam-Domänen (PF02746 und PF13378) gezählt, die COG4948 entsprechen (Einzelheiten finden Sie unter Materialien und Methoden) und den Anteil der COG4948-Proteine ​​​​an allen CDS in jedem Genom berechnet. Unter den 47.894 Artencluster-repräsentativen Genomen von GTDB (R202) rangierten alle 48 Genome der SAR202-Gruppe I (o__UBA1151 in GTDB) in den Top 66, mit Ausnahme eines, das im Verhältnis zu COG4948 den 134. Platz belegte (Abb. 4a), was zeigt, dass die Die paraloge Expansion von COG4948 ist ein herausragendes Merkmal der SAR202-Gruppe I in allen Prokaryoten.

a Anteil der COG4948-Proteine ​​an den Artencluster-repräsentativen Genomen von GTDB (Release 202; 47.894 Genome). Es werden nur die 200 besten Genome mit dem höchsten Anteil berücksichtigt. Genome von o_UBA1151 (SAR202 Gruppe I) sind mit einer deutlichen Farbe gekennzeichnet. Aufgrund des hohen Anteils von COG4948 sind in dieser Zahl alle 48 o__UBA1151-Genome enthalten. Der schwarze Pfeil auf der y-Achse gibt den Anteil der vier in dieser Studie sequenzierten SAR202-Genome an (~2,8 %). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. b SSN-Analyse (Sequence Similarity Network) verschiedener COG4948-Proteine, die im JH545-Genom vorhergesagt wurden. UniProt-Proteine ​​mit den beiden Pfam-Domänen PF02746 und PF13378 wurden zusammen mit den 80 COG4948-Proteinen des Stammes JH545 in die Analyse einbezogen. In dieser Abbildung blieben nur die Proteincluster einschließlich der JH454-Proteine ​​erhalten, nachdem ein Schwellenwert auf den Alignment-Score (≥ 150) angewendet wurde. Knoten (Proteine) werden entsprechend ihrer Taxonomie auf Stammebene entsprechend den Farbcodes unten gefärbt. Die 80 COG4948-Proteine ​​des JH545-Genoms sind in roten Dreiecken dargestellt. Die vier experimentell untersuchten Proteine ​​sind mit schwarzen Rechtecken gekennzeichnet (UniProt ID: D8ADB5, C9A1P5, C6CBG9 und A8RQK7).

Wir analysierten die Sequenzdivergenz zwischen den 80 COG4948-Proteinen des JH545-Genoms, indem wir mithilfe des Enzyme Similarity Tool (EFI-EST) der Enzyme Function Initiative ein Sequenzähnlichkeitsnetzwerk (SSN) aufbauten42. Die meisten der ca. 70 Cluster, die JH545-Proteine ​​als Mitglieder enthielten, enthielten nur ein JH545-Gen, was darauf hinweist, dass die JH545-COG4948-Proteine ​​stark divergent sind (Abb. 4b). Während viele der größten COG4948-Cluster verschiedene Bakterienstämme umfassten, bestanden viele kleine Cluster hauptsächlich aus Chloroflexota, was darauf hindeutet, dass die COG4948-Proteinfamilie, die weit über Prokaryoten verteilt ist, in Chloroflexota diversifizierte. Nur der größte Cluster, der zwei JH545-Proteine ​​umfasste, enthielt biochemisch untersuchte Proteine43 (Abb. 4b).

Wir schlagen vor, dass sieben Sätze von Paralogs (COG1028, COG0667, COG3618, COG4948, COG1063, COG3836 und COG0329), einschließlich der am häufigsten vorkommenden COG4948-Paralogs, konzertiert auf parallelen Wegen wirken, die Energie aus verschiedenen Kohlenhydraten gewinnen (Abb. 5b), und wir liefern experimentelle Beweise dafür, dass kultivierte SAR202-Zellen der Gruppe I auf vorhergesagte Substrate dieser Signalwege reagieren (Abb. 5a). Zu den größten COG-Sets in den SAR202-Genomen dieser Studie gehörten neben den Mandelatracemasen (COG4948) auch NAD(P)-abhängige Dehydrogenasen (COG1028), Aldolasen (COG3836) und Oxidoreduktasen (COG0667; Ergänzungstabelle 3). Diese Enzyme kommen in nicht-phosphorylierenden Stoffwechselwegen verschiedener Zucker und deren Säurekatabolismus vor (z. B. Fucose, Rhamnose, Arabinose und Xylose)39, 44,45,46,47,48,49. Im Mittelpunkt dieser Wege stehen die Paarungsenzyme aus den beiden größten Paraloggruppen, Mandelat-Racemase-ähnlichen Enzymen und NAD(P)-abhängigen Dehydrogenasen, die eine Dehydratisierungsreaktion katalysieren, gefolgt von einer Oxidationsreaktion, die zu einem Elektronenfluss für die Atmung führt. Eine frühere SAR202-Pangenomanalyse der Variation der COG-Kopienzahl ergab signifikante positive Korrelationen in der Anzahl der Kopien derselben sieben COGs (Ergänzungstabelle 3) in SAR202-Gruppe-I-Genomen im Vergleich zu anderen SAR202-Genomen12. Die phylogenetisch korrelierten Verteilungen dieser Paralog-Erweiterungen stützen unsere Vorhersage, dass sie koordinierte Stoffwechselrollen spielen.

a Wachstum des Stammes JH545 auf verschiedenen Kohlenstoffverbindungen, für deren Metabolisierung voraussichtlich COG4948-Enzyme erforderlich sind. Den ASW5x-Medien (Ergänzungstabelle 1) wurden Kohlenstoffverbindungen in einer Endkonzentration von 250 μM zugesetzt. Nur Kohlenstoffmischung, es wurden keine zusätzlichen Kohlenstoffverbindungen hinzugefügt, mit Ausnahme der Kohlenstoffmischung, die bereits in den ASW5x-Medien enthalten ist. Die Inkubation erfolgte im Dunkeln bei 20 °C. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwerte ± SEM dargestellt. Beachten Sie, dass die Fehlerbalken ausgeblendet werden, wenn sie kürzer als die Größe der Symbole sind. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. b Mutmaßliche nicht-phosphorylierende katabolische Wege von L-Fucose und L-Rhamnose, abgeleitet aus den SAR202-Genomdaten. Die Anzahl der den COGs zugeordneten Proteine ​​wird bei jedem Schritt in Klammern neben den COG-IDs angegeben.

Wir haben nicht-phosphorylierende Wege für die Oxidation von zwei für Meeresumwelt relevanten Zuckern, Fucose und Rhamnose50, 51, in den Genomen der kultivierten SAR202-Stämme auf der Grundlage mehrerer früherer Studien46,47,52,53,54,55 rekonstruiert (Abb. 5b). ). Obwohl bekannt ist, dass sowohl Rhamnose als auch Fucose in vielen Organismen über Wege abgebaut werden, die Phosphorylierung beinhalten, wurden diese Kinase-abhängigen Wege in den Genomen nicht gefunden. Dies legt nahe, dass die in Abb. 5b gezeigten rekonstruierten nicht-phosphorylierenden Wege als einzige katabolische Wege für beide Zucker in diesen Stämmen dienen könnten. Bei der Rekonstruktion des Signalwegs teilen sich L-Fucose und L-Rhamnose bei jedem Schritt die gleiche COG-Annotation, wodurch Pyruvat und Lactat oder Lactaldehyd als Endprodukte entstehen. Sieben der acht COGs, die in den rekonstruierten Pfaden für den Fucose- und Rhamnose-Katabolismus dargestellt sind, stammten aus den oben beschriebenen zahlreichen Paralogsätzen und reichten von 9 bis 80 Varianten jedes COG (Ergänzungstabelle 3).

Wir haben die Wachstumsreaktion von JH545-Zellen auf externe Metaboliten getestet, von denen vorhergesagt wurde, dass sie Substrate für die oben vorgeschlagenen katabolen Wege sind. In diesen Experimenten verwendeten wir ein definiertes Medium auf Basis von künstlichem Meerwasser, dem wir die gleichen Cofaktoren und organischen Verbindungen hinzufügten, die für die ursprüngliche Isolierung der Stämme verwendet wurden. Wir haben nicht untersucht, ob die getesteten Substrate als alleinige Kohlenstoffquellen dienen könnten, da die Wachstumsrate der Zellen sehr gering ist und weil an oligotrophe Ökosysteme angepasste Zellen im Vergleich zu kopiotropen Zellen häufig eine geringere metabolische Flexibilität aufweisen, wenn sie mit vereinfachten Kohlenstoffmischungen belastet werden. Alle getesteten Substrate, einschließlich ʟ-Fucose, ʟ-Rhamnose, deren Lacton- und Säureformen sowie Ascorbat, steigerten das Wachstum des Stammes JH545 in künstlichen Meerwassermedien (Abb. 5a). Mit steigenden Wachstumsraten waren die Zelldichten in der späten exponentiellen Phase (~35 Tage Inkubation) in Kulturen mit verändertem Substrat mehr als zehnmal höher, obwohl die Kulturen in der stationären Phase ähnliche Dichten erreichten. Ascorbat wurde getestet, da ein Ascorbat-Abbauweg, der ein COG4948-Enzym39,48 erfordert, im JH545-Genom nahezu vollständig war (ergänzende Abbildung 9).

Die vertikale Verteilung der durch JH545 repräsentierten Population auf Artenebene (im Folgenden „JH545-Population“) in marinen Metagenomen folgte Mustern, die zuvor für mehrere Mitglieder der SAR202-Gruppe I beobachtet wurden12. In Metagenomen von Tara Oceans und der Station ALOHA war die relative Häufigkeit der JH545-Population in der mesopelagischen Zone (200–1000 m) höher als in der euphotischen Zone (Oberfläche bis 200 m) (Mann-Whitney-U-Test, P = 1,78 ×). 10−10, einseitig; Abb. 6c). In Metagenomen aus mehreren Meeresgräben nahm die relative Häufigkeit der JH545-Population im Allgemeinen mit zunehmender Tiefe über der hadopelagischen Zone (unter 6000 m) zu, wo ihre relative Häufigkeit abnahm (Abb. 6a, b). Angesichts des allgemeinen Rückgangs der Zellzahlen mit zunehmender Wassertiefe56,57,58 ist die JH545-Population wahrscheinlich in der gesamten Wassersäule des Ozeans zu finden und erreicht ihre höchste Konzentration in der epipelagischen Zone, nimmt jedoch in der relativen Häufigkeit im dunklen Ozean zu. Diese Schlussfolgerung steht auch im Einklang mit neueren Studien, die eine höhere SAR202-Zellhäufigkeit in der euphotischen Zone im Vergleich zur aphotischen Zone im Atlantischen Ozean und in der Framstraße berichten, gemessen durch FISH-basierte Zellzählung12,59. Die wahrscheinlich hohe absolute Häufigkeit der in den euphotischen Zonen beobachteten JH545-Population scheint im Widerspruch zu den Beobachtungen der Wachstumshemmung durch Hell-Dunkel-Zyklen und des Todes der kultivierten Stämme bei Dauerlicht bei Einwirkung von weißem Breitspektrumlicht zu stehen (Abb. 2b, c). . Um diese Beobachtungen in Einklang zu bringen, nehmen wir an, dass JH545 seine zwei Kopien von Heliorhodopsin verwendet, um Funktionen zu regulieren, die durch Licht negativ beeinflusst werden, wodurch seine Anfälligkeit für Hemmung gemindert wird34, und wir stellen fest, dass das Wirkungsspektrum für die Lichthemmung nicht bestimmt wurde und die Zellen dies sein könnten empfindlich gegenüber Frequenzen, die normalerweise in der Wassersäule absorbiert werden. Unabhängig davon deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Herausforderung bei der Kultivierung dieser Zellen teilweise durch ihre Lichtempfindlichkeit erklärt werden könnte.

a, c Relative Häufigkeiten werden für verschiedene Stationen und Tiefen aus den vier Meeresgräben mit Wassertiefen von mehr als 6000 m (a) und den Stationen ALOHA und TARA Oceans (c) aufgetragen. Für TARA Oceans wurden nur die Stationen mit Proben aus Wassertiefen von weniger als 100 m und mehr als 250 m verwendet. Die gepunktete horizontale Linie in (c) zeigt eine Tiefe von 200 m an, die Grenze zwischen epipelagischer (euphotischer) und mesopelagischer Zone. Die Blasenfarben in (c) entsprechen den Ozeanen, in denen sich die Probenahmestationen befinden, entsprechend der Legende rechts: SO, der Südliche Ozean; IO, der Indische Ozean; SAO und NAO, der Süd- bzw. Nordatlantik; SPO und NPO, der Süd- bzw. Nordpazifik. b Die in (a) verwendeten Daten wurden erneut aufgetragen, um die Änderung der relativen Häufigkeit als Funktion der Tiefe zu zeigen. Regressionslinie (in Blau) und Konfidenzintervalle (95 %; graue Schattierung) wurden mit der Funktion „geom_smooth“ des Pakets ggplot2 R mit der Methode „gam“ (verallgemeinertes additives Modell) gezeichnet. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wir schlagen vor, dass die vertikale Verteilung der Mitglieder der SAR202-Gruppe I, die durch die JH545-Population repräsentiert werden, mit ihren hier berichteten Stoffwechselmerkmalen in Einklang gebracht werden kann. Die Verbindungen, die das Wachstum von JH545 förderten (z. B. Fucose und Rhamnose) und verwandte Verbindungen, von denen wir annehmen, dass JH545- und SAR202-Bakterien der Gruppe I sie ebenfalls nutzen könnten, kommen im Oberflächenozean größtenteils als Monomere in Polysacchariden vor, die vom Phytoplankton produziert werden51. Das JH545-Genom verfügte über ein begrenztes Repertoire an Glycosidhydrolasen (GHs) und es fehlten repräsentative GH-Familien, die als Fucosidase und Rhamnosidase bezeichnet wurden (z. B. GH29, GH95, GH141, GH78 und GH106)41, 50,60. SAR202 Gruppe I kann Monomerverbindungen und ihre Stoffwechselprodukte abfangen, die während des Abbaus von Polysacchariden durch andere Taxa (z. B. Bacteroidia, Gammaproteobacteria und Verrucomicrobiota) in die Wassersäule diffundieren (Ref. 51 und Referenzen darin), von denen viele zu viel fähig sind schnelleres Wachstum und hätten als Spezialisten einen Wettbewerbsvorteil, wenn Polysaccharide verfügbar wären. Im dunklen Ozean, wo die Polysaccharide erschöpft sind, können paraloge Generweiterungen der Gruppe I jedoch einen Wettbewerbsvorteil verschaffen, indem sie ihr ermöglichen, eine Vielzahl von Zuckern, Zuckersäuren und verwandten Verbindungen zu verwenden, was zu der beobachteten Zunahme der relativen Häufigkeit führt. Die Piezotoleranz von SAR202-Zellen würde ihnen auch einen Wettbewerbsvorteil im dunklen Ozean verschaffen61. Wir stellen jedoch fest, dass es andere SAR202-Gruppen gibt (z. B. Gruppe III), von denen bekannt ist, dass sie wesentlich zur hohen relativen Häufigkeit der SAR202-Gruppe in den tiefsten Meeresregionen beitragen. Die Isolierung und Charakterisierung einer größeren Vielfalt von SAR202, insbesondere der für den Dunklen Ozean typischen Abstammungslinien, könnte zukünftige Forschungen vorantreiben, die auf die Rekonstruktion der Kohlenstoffchemie und -ökologie im Dunklen Ozean abzielen.

Es wurde vorgeschlagen, dass evolutionäre Diversifizierungen paraloger Enzyme in SAR202-Zellen diesen Zellen zugute kommen, indem sie den Bereich organischer Verbindungen erweitern, die sie metabolisieren können8,12. Um die nicht-phosphorylierenden Wege der Zuckeroxidation, über die wir berichten, und die Möglichkeit eines viel größeren Satzes paralleler Wege in denselben Zellen zu erklären, nehmen wir an, dass sich SAR202-Zellen der Gruppe I entwickelt haben, um relativ seltene Kohlenhydratverbindungen zu nutzen, die von Taxa nicht geerntet werden Spezialisiert auf gängigere Kohlenhydratarten. Kohlenhydrate sind aufgrund der Chiralität der Monomere, der Vielfalt der von ihnen gebildeten Bindungen und Modifikationen wie O-Methylierung und Sulfatierung strukturell komplex. In diesem Szenario nutzt SAR202 eine Nische und gewinnt eine Klasse von Verbindungen, die aufgrund ihrer geringen Häufigkeit und strukturellen Vielfalt widerspenstig sind. Diese Kombination von Merkmalen, dh hohe molekulare Komplexität und niedrige Konzentrationen einzelner molekularer Spezies, ist mit der Hypothese der molekularen Diversität62 verbunden, einer führenden Erklärung für die Bindung von Ozeankohlenstoff in gelösten Molekülen mit tausendjährigen Umsatzzeiten. Unsere Ergebnisse stehen nicht im Widerspruch zu dieser Hypothese; Sie schlagen stattdessen eine Klasse von Verbindungen vor, die sich aus den gleichen Gründen ansammeln würden, wenn ein bestimmter Zelltyp, wie etwa SAR202 Gruppe I, nicht einen einzigartigen Mechanismus zu ihrer Gewinnung entwickelt hätte. Es ist zu beachten, dass Kohlenstoffspeicher im dunklen Ozean auch von anderen SAR202-Gruppen beeinflusst werden könnten. Beispielsweise wurde vermutet, dass SAR202 der Gruppe III, von dem bekannt ist, dass es im dunklen Ozean häufiger vorkommt als Gruppe I, zum Abbau und zur Umwandlung widerspenstiger organischer Materie beiträgt, indem es ein erweitertes Repertoire an Flavin-abhängigen Monooxygenasen nutzt8,12.

Zusammenfassend beschreiben wir die erfolgreiche Kultivierung der häufig vorkommenden marinen Bakteriengruppe SAR202, einer monophyletischen Überordnung innerhalb der Klasse Dehalococcoidia des Stammes Chloroflexota. Die SAR202-Stämme wuchsen sehr langsam und ihr Wachstum wurde durch Lichteinwirkung weiter gehemmt; Diese Eigenschaften könnten erklären, warum sie bisher nicht kultiviert wurden. Wir zeigen, dass diese Zellen Paralog-Erweiterungen enthalten und dass diese Paralogs in nicht-phosphorylierenden Wegen für den Abbau von Zuckern und ihren Lacton- und Säureformen angeordnet werden können. Wir zeigen, dass Fucose und Rhamnose, vorhergesagte Substrate dieser Wege, das Wachstum des SAR202-Isolats verstärkten.

Wir haben die Physiologie einer Überordnung von Bakterien untersucht, die an der Oxidation verschiedener Formen von semilabilem organischem Kohlenstoff beteiligt sind, und es scheint wahrscheinlich, dass weitere Studien der verschiedenen Zellen in dieser Gruppe zu einem mechanistischeren Verständnis beitragen werden der Kohlenstoffkreislauf des Ozeans. Zellkulturen neuartiger Prokaryoten bieten die Möglichkeit, ein breites Spektrum zellulärer Eigenschaften zu untersuchen, die nicht allein anhand von Genomen bestimmt werden können. Wechselwirkungen dieser langsam wachsenden Zellen mit organischen Kohlenstoff-Exometaboliten und ihre ungeklärte Lichtempfindlichkeit sind vielversprechende Wege für zukünftige Arbeiten. Studien zur Funktion von SAR202-Archaella und zur Integration in die Zellhülle von SAR202 könnten Hinweise auf die Ökologie und Zellarchitektur dieser ungewöhnlichen Zellen liefern. Die von uns berichteten Ergebnisse lieferten überraschende Einblicke in die Herausforderungen, die den SAR202-Anbau lange Zeit ins Stocken geraten ließen. Ob die Vielfalt der noch nicht kultivierten Linien von SAR202-Zellen, die im dunklen Ozean leben, durch ähnliche Eigenschaften erklärt werden kann, bleibt abzuwarten.

Im Oktober 2017 wurden an zwei Stationen (GR1 und GR3) im Westkoreanischen Meer (Gelbes Meer) Meerwasserproben aus einer Tiefe von 10 m für die Hochdurchsatzkultivierung (HTC) auf der Grundlage der Verdünnung bis zur Extinktion und der Amplikonanalyse gesammelt (Ergänzende Abbildung 1a). Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Wasserproben sind in der ergänzenden Abbildung 1b dargestellt. Die Gesamtzahl der Prokaryoten wurde durch Zählen der mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) gefärbten Zellen unter Verwendung eines Epifluoreszenzmikroskops (Nikon 80i, Nikon) nach der Filtration unter Verwendung eines Polycarbonatmembranfilters mit einer Porengröße von 0,2 μm (Millipore) bestimmt. . Kulturmedien für HTC (LNHM) wurden unter Verwendung einer Meerwasserprobe hergestellt, die 2016 aus dem Ostmeer (Tiefe 10 m) entnommen wurde. Kurz gesagt, die Meerwasserprobe wurde mit einem Polyethersulfon-Membranfilter mit einer Porengröße von 0,2 μm (Pall) gefiltert. autoklaviert (1,5 h), mit CO2 gespült (8 h), belüftet (24 h) und mit Kohlenstoffquellen, Makronährstoffen (Stickstoff- und Phosphorquellen), Spurenmetallen, Vitaminen und Aminosäuren ergänzt (Ergänzungstabelle 1). Die Meerwasserproben wurden dann mit Kulturmedium auf eine Konzentration von 5 Zellen ml-1 verdünnt und (1 ml pro Vertiefung) in Mikrotiterplatten mit 48 Vertiefungen (BD Falcon) verteilt. Die Platten wurden einen Monat lang bei 20 °C im Dunkeln oder unter LED-Licht (Philips; ähnlichste Farbtemperatur 3000 K; Lichtintensität ~155 μmol Photonen m–2 s–1) mit einem Hell/Dunkel-Zyklus von 14 inkubiert: 10 Std. Das mikrobielle Wachstum in jeder Vertiefung wurde mittels Durchflusszytometrie (GUAVA EasyCyte Plus Durchflusszytometer und Guava CytoSoft (v5.3, Millipore)) nach Färbung mit SYBR Green I (Life Technologies) untersucht und bei mehr als 5,0 × 104 als wachstumspositiv aufgezeichnet Zellen mL−1 wurden nachgewiesen. Kulturen aus wachstumspositiven Vertiefungen wurden für weitere Analysen verwendet und als Glycerinstamm (10 %, v/v) bei –80 °C gelagert.

Phylogenetische Analysen wachstumspositiver Kulturen basierten auf PCR-Amplifikation und Sequenzierung von 16S-rRNA-Genen. DNA-Vorlagen für die PCR wurden aus wachstumspositiven Kulturen unter Verwendung der InstaGeneTM Matrix (Bio-Rad) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Die Amplifikation der 16S-rRNA-Gene wurde durch PCR unter Verwendung der Primer 27F und 1492R durchgeführt, gefolgt von einer Sanger-Sequenzierung mit den Primern 800R und 518F (Macrogen Inc., Korea). Die taxonomische Klassifizierung von 610 Stämmen aus den HTC-Experimenten wurde mit dem Befehl „classify.seqs“ des Mothur-Softwarepakets (v1.39.5)63 unter Verwendung der SILVA-Datenbank SSURef NR99 (Version 132)64 als Referenz durchgeführt. Für eine verfeinerte taxonomische und phylogenetische Analyse der SAR202-Isolate wurden die 16S-rRNA-Gensequenzen mit dem SINA-Online-Aligner (v1.2.11, http://www.arb-silva.de/aligner)65 ausgerichtet und in das ARB-Programm66 importiert. und mithilfe der ARB-Sparsamkeit in den Führungsbaum der SILVA-Datenbank SSURef NR99 (Release 132)64 eingefügt. Nach manueller Kuration wurden die ausgerichteten Sequenzen der Isolate und ihrer phylogenetischen Verwandten mit dem Filter „ssuref:bacteria“ exportiert. Phylogenetische Bäume mit maximaler Wahrscheinlichkeit wurden mit RAxML67 (v8.2.12) mit der GTRGAMMA-Methode einschließlich 100 Bootstrap-Replikaten erstellt und mit der MEGA-Software (v7.0)68 visualisiert.

Zwei Liter jeder Meerwasserprobe (GR1 und GR3) wurden durch einen Polyethersulfon-Membranfilter mit einer Porengröße von 0,2 μm (Supor, Pall) filtriert. Die DNA wurde mit dem DNeasy PowerWater Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers direkt aus den Membranfiltern extrahiert. Die V4-V5-Regionen der 16S-rRNA-Gene wurden mithilfe von Fusionsprimern amplifiziert, die auf der Grundlage der Universalprimer 518F und 926R69 entwickelt wurden. Die gepoolten PCR-Produkte wurden auf der Illumina MiSeq-Plattform (300 bp, Paired-End; Chunlab Inc.) sequenziert. Die Analysen der 16S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzen wurden mit QIIME270 nach Primer-Trimmen mit Cutadapt (v2.7)71 durchgeführt.

Die SAR202-Stämme wurden unter Verwendung von LNHM5x bei 20 °C im Dunkeln gezüchtet und gehalten. Wachstumsexperimente wurden mit LNHM, LNHM5x und ASW5x durchgeführt. Die detaillierten Rezepturen der Medien sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Das Bakterienwachstum wurde mittels Durchflusszytometrie überwacht und die Reinheit und Identität der Kulturen wurden regelmäßig durch Sequenzierung der amplifizierten 16S-rRNA-Gene und durch mikroskopische Untersuchung bestimmt.

Das Wachstum des Stammes JH545 wurde bei Temperaturen im Bereich von 4 bis 37 °C im Dunkeln überwacht. Wachstumssubstrattests wurden unter Verwendung von ʟ-Rhamnose, ʟ-Rhamnono-1,4-lacton, ʟ-Rhamnonat, ʟ-Fucose, ʟ-Fucano-1,4-lacton, ʟ-Fuconat und Ascorbat durchgeführt. Alle getesteten Verbindungen wurden von Sigma-Aldrich bezogen. Diese Chemikalien wurden den ASW5x-Medien in einer Endkonzentration von 250 μM zugesetzt. Die Kulturen wurden im Dunkeln bei 20 °C inkubiert.

Für die erste Untersuchung der Auswirkung der Lichteinwirkung auf das SAR202-Wachstum (Abb. 2b) wurden Zellen in LNHM mit einer anfänglichen Zelldichte von ~1,0 × 104 Zellen ml−1 inokuliert und in einer mit LED ausgestatteten Kammer (3000 K; Phillips) mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 14:10 h. Die Lichtintensität betrug ~155 μmol Photonen m−2 s−1. Um den Einfluss der Lichtintensität auf das SAR202-Wachstum zu testen (Abb. 2c), wurde eine maßgeschneiderte Ausrüstung mit einem LED-Array (3000 K) und einem Lichtdimmer verwendet und die Lichtintensitäten wurden auf ~45 (schwaches Licht) eingestellt. , ~89 (mittleres Licht) und ~134 (starkes Licht) μmol Photonen m−2 s−1. Während des Tests blieben die Lichter durchgehend an. Alle Experimente umfassten Kontrollproben, die durch Umwickeln der Röhrchen oder Kolben mit Aluminiumfolie ständig im Dunkeln gehalten wurden. Die Lichtintensität wurde mit einem digitalen Lichtmesser (TES-1335; TES) gemessen.

Die Zellmorphologie wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM; CM200, Philips) und Rasterelektronenmikroskopie (REM; S-4300 und S-4300SE, Hitachi) beobachtet. Um Proben für die TEM vorzubereiten, wurden 20 ml einer mit 2,5 % Glutaraldehyd vorfixierten Kultur unter Verwendung einer Polycarbonatmembran mit einer Porengröße von 0,2 μm filtriert, auf der mit Formvar/Kohlenstoff beschichtete Kupfergitter platziert waren, und anschließend wurden die Gitter mit Uranylacetat gefärbt (2). %). Für die Dünnschnitt-TEM wurden zentrifugierte Zellen aus 800 ml Kultur einer primären Fixierung mit Karnovsky-Lösung (2 % Paraformaldehyd, 2,5 % Glutaraldehyd), einer Nachfixierung mit 2 % OsO4 und einer En-bloc-Färbung mit 0,5 % Uranylacetat nacheinander unterzogen Dehydrierung mit 30, 50, 70, 80, 90 und 100 % Ethanol und Einbettung mit Harz (EMBed-812, Electron Microscopic Science). Abschließend erfolgte das Schneiden mit einem Diamantmesser. Dünne Schnitte wurden mit Uranylacetat (2 %) gefärbt. Für die SEM-Analyse wurden 100 ml Kultur durch Zentrifugation konzentriert, mit 2,5 % Glutaraldehyd fixiert, mit 1 % OsO4 nachfixiert, mit 30, 50, 70, 80, 90 und 100 % Ethanol dehydriert und mit Hexamethyldisilazan chemisch getrocknet ( Sigma-Aldrich). Behandelte Proben wurden vorsichtig auf ein Deckglas montiert und mit einer dünnen Kohlenstoffschicht beschichtet.

Genomische DNA der SAR202-Stämme wurde aus Zellpellets extrahiert, die durch Zentrifugation von Flüssigkulturen (~1 l) unter Verwendung des DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers erhalten wurden. Die genomische DNA der Stämme JH545 und JH1073 wurde für die Konstruktion der 20-kb-SMRTbell-Bibliothek verwendet, die auf der PacBio RS II-Plattform (Pacific Biosciences) sequenziert wurde. Die De-novo-Assemblierung der Rohsequenzierungslesevorgänge wurde mit dem RS_HGAP_Assembly.2-Protokoll von SMRT Analysis (v2.3.0) durchgeführt, was zu einem einzelnen Contig führte. Der Contig wurde mit Circlator (v1.5.5)72 zirkularisiert und mit dem RS_Resequencing.1-Protokoll von SMRT Analysis poliert, um die endgültige fehlerkorrigierte Genomsequenz zu erhalten. Die Genomsequenzierung der Stämme JH702 und JH639 wurde auf der Illumina HiSeq-Plattform (2 × 150 bp) durchgeführt. Rohlesevorgänge wurden mithilfe von BBDuk mit den folgenden Optionen gekürzt: ktrim=rk=23 mink=11 hdist=1 tpe tbo ftm=5 qtrim=rl trimq=10 minlen=100. Die Zusammenstellung der Illumina-Sequenzierungsdaten wurde mit SPAdes v3.11.1 in einem Mehrzellenmodus mit Lesefehler- und Fehlanpassungskorrektur73 durchgeführt.

Die Genomsequenzen wurden zur Annotation an das IMG-ER-System übermittelt. Prokka (v1.12)74 wurde auch für Anmerkungen verwendet. Die vorhergesagten Proteinsequenzen wurden mit BlastKOALA75 und KofamKOALA76 zur Rekonstruktion des Stoffwechselwegs basierend auf KEGG Orthologs (KOs) analysiert. Für eine genauere und detailliertere funktionale Annotation wurden auch Annotationen mit eggnog-mapper (v2.0.1)77 und hmmsearch (v3.3) gegen Proteindatenbanken wie Pfam durchgeführt. Die Analyse von CAZymes wurde mit dbCAN278 durchgeführt. Mit BioRender (https://biorender.com) wurde eine Karte der Stoffwechselwege erstellt. ANIb-Werte zwischen Genomen wurden mit JSpeciesWS79 berechnet. Genominseln wurden mit IslandViewer 480 vorhergesagt. Der Genomvergleich wurde mit dem BLAST Ring Image Generator (BRIG)81 visualisiert.

Die SAR202-Genomsequenzen der vorliegenden Studie und einer früheren Studie12 wurden mithilfe von GTDB-Tk (v1.7.0) klassifiziert, was darauf hinwies, dass die Genome laut GTDB zu etwa 10 verschiedenen Ordnungen gehörten. Repräsentative Genome dieser Ordnungen wurden verwendet, um einen phylogenomischen Baum der SAR202-Klade zu erstellen. Wir haben die UBCG-Pipeline82 verwendet, um eine verkettete Ausrichtung der Kerngene zu erhalten. Ein Maximum-Likelihood-Baum wurde mit RAxML (v8.2.12)67 erstellt, mit einer PROTGAMMAAUTO-Option einschließlich 100 Bootstrap-Iterationen.

Genomregionen um die HeR-Gene des JH545-Genoms wurden mit Easyfig83 visualisiert. Das Alignment mehrerer Aminosäuren von HeRs aus JH545 und dem zuerst charakterisierten HeR (48C12) wurde mit ClustalW84 durchgeführt. Zur Visualisierung der Ausrichtung wurde das Clustal-X-Farbschema des Jalview (v2.11.1.3)85 angewendet.

Zur phylogenetischen Analyse wurden verschiedene FlaB-Sequenzen gesammelt. Zusätzlich zur Literaturrecherche wurden mutmaßliche Orthologe von JH545-FlaBs mit SHOOT86 (https://www.shoot.bio/) durchsucht, was dazu führte, dass nur archaische FlaBs gefunden wurden. Bakterielle FlaBs wurden mit BlastP in IMG-ER und NCBI (Nr.-Datenbank) mit JH545-FlaBs als Abfragen gesucht. Zusätzlich wurde AnnoTree mit K07325 (Archaeen-Flagellin FlaB) als Abfrage durchsucht. Die gesammelten Sequenzen wurden mit MUSCLE abgeglichen, gefolgt von der Baumbildung mit RAxML (v8.2.12) mit der Option PROTGAMMAAUTO. FlaBs von MAGs oder SAGs, die mit anderen Bakterienstämmen als Chloroflexota assoziiert sind, wurden aus den Analysen entfernt, da diese FlaBs die einzigen waren, die in ihren jeweiligen Stämmen gefunden wurden, was auf die Möglichkeit einer Kontamination schließen lässt. Einige archaische FlaBs, die viel länger als andere Sequenzen sind, wurden ebenfalls entfernt. Einige Genome, in denen FlaB gefunden wurde, wurden verwendet, um die Genkarte des Archaella-Genclusters mit Easyfig zu visualisieren.

Insgesamt 80 Proteine ​​wurden COG4948 durch die IMG-ER-Annotation des JH545-Genoms zugeordnet, was auch durch die Conserved Domain Search87 (v3.18) am NCBI verifiziert wurde. Eine Suche in der Pfam-A-Datenbank (von Pfam_Scan.pl; beide verfügbar unter https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/Pfam/) ergab, dass 74 COG4948-Proteine ​​sowohl PF02746- als auch PF13378-Domänen aufwiesen. Die verbleibenden sechs Proteine ​​​​wiesen entweder PF13378- (vier Proteine) oder PF02746-Domänen (zwei Proteine) auf. Die beiden Pfam-Domänen wurden nur in 80 COG4948-Proteinen gefunden. Basierend auf diesen Ergebnissen, die eine Übereinstimmung zwischen COG4948 und den beiden Pfam-Domänen zeigen, haben wir beschlossen, die beiden Pfam-Domänen zur ungefähren Berechnung des Anteils von COG4948-Proteinen in 47.894 Artencluster-repräsentativen Genomen der GTDB (R202) zu verwenden. Die genomischen FAA-Dateien (gtdb_proteins_aa_reps_r202.tar.gz) wurden aus dem GTDB-Repository (https://data.gtdb.ecogenomic.org/) heruntergeladen und mit hmmsearch (v3.3) anhand der hmm-Dateien der beiden Pfam-Domänen durchsucht. mit der Option „cut_tc“. Der ungefähre Anteil der COG4948-Proteine ​​in jedem Genom wurde berechnet, indem die Anzahl der hmmsearch-Treffer durch die doppelte Anzahl der CDS dividiert wurde. Die Ergebnisse wurden mit dem R-Paket „tidyverse“ visualisiert.

Die 80 COG4948-Proteinsequenzen von JH545 wurden dem Enzyme Similarity Tool (EFI-EST; https://efi.igb.illinois.edu/efi-est/)42 übermittelt, um eine SSN zu generieren. Insgesamt 77.142 Proteine ​​in der UniProt-Datenbank (v2020_02), die die beiden Pfam-Domänen hatten, wurden in das SSN aufgenommen, das mit BLAST mit Standardoptionen erstellt wurde. Die erhaltene SSN wurde mit Cytoscape (v3.7.2)88 untersucht. Nach Anwendung eines Cutoff-Schwellenwerts des Alignment-Scores (größer oder gleich 150) wurden Cluster, die die 80 COG4948-Proteine ​​des Stamms JH545 enthielten, zur Visualisierung zurückgehalten.

Die Rekonstruktion der nicht-phosphorylierenden Fucose- und Rhamnose-Abbauwege basiert auf einer KEGG-Wegkarte (Fructose- und Mannose-Metabolismus; Karte00051), MetaCyc-Wegen (L-Fucose-Abbau II/III und L-Rhamnose-Abbau II/III) und mehreren Veröffentlichungen46, 47,52,53,54,55. Bei Bedarf wurden in früheren Berichten charakterisierte Proteine ​​in der UniProt-Datenbank untersucht oder durch CD-Suche am NCBI analysiert, um ihre COG-Zuordnungen zu ermitteln.

Die relative Häufigkeit der JH545-Population in marinen Metagenomen wurde mit CoverM (v0.6.1; https://github.com/wwood/CoverM) geschätzt. Metagenome aus mehreren Meeresgräben, der Station ALOHA (gesammelt im Dezember 2011) und einigen Tara Oceans-Stationen wurden von SRA heruntergeladen und mit BBduk (v38.86)89 qualitätsgetrimmt. Ribosomale RNA- und tRNA-Gene des JH545-Genoms wurden vor den Analysen maskiert. CoverM wurde mit den folgenden Optionen ausgeführt: --mapper bwa-mem --methods relative_abundance --min-read-aligned-length 50 --min-read-percent-identity 95. Beachten Sie, dass nur das JH545-Genom als Referenz verwendet wurde Genom. Der Schwellenwert für „--min-read-percent-identity“ wurde auf 95 % festgelegt, ein ANI-Wert, der häufig zur Artenabgrenzung verwendet wird, da wir die relative Häufigkeit von Metagenom-Reads abschätzen wollten, die als von derselben Art stammend angesehen werden könnten Art wie JH545. Die Liste der Metagenomproben finden Sie in den Zusatzdaten 2.

Die Analyse zellulärer Fettsäuremethylester (FAMEs) wurde unter Verwendung des Standardprotokolls durchgeführt, das vom MIDI/Hewlett-Packard Microbial Identification System bereitgestellt wird. Um FAMEs zu extrahieren, wurden Zellen des Stamms JH545 durch einstündige Zentrifugation bei 13.000 × g am Ende der exponentiellen Wachstumsphase in einem 400-ml-Volumen Flüssigkultur (ASW5x-Medium) geerntet. Die extrahierten FAMEs wurden verseift und methyliert, bevor sie mit einem Gaschromatographen (Agilent 7890 GC) mit TSBA6-Datenbank des Sherlock Microbial Identification System (MIDI) Version 6.1 analysiert wurden.

Lucifugimonas (Lu.ci.fu.gi.mo'nas. L. fem. n. lux, lucis, Licht; L. fem. n. fuga, Flug; L. fem. n. monas, eine Einheit, Monade; NL fem. n. Lucifugimonas, eine Monade, die dunkle Lebensräume bevorzugt).

Aerob, oligotroph und chemoheterotrop. Gramnegativ mit Monodermhülle. Die Zellen sind unbeweglich und dimorph mit kurzen Stäbchen von etwa 0,8 × 0,4 µm und Kokken mit einem Durchmesser von etwa 0,5 µm. Bilden Sie keine Kolonien auf festen Agarplatten. Wächst sehr langsam und erreicht die stationäre Phase nach etwa 50 Tagen Wachstum in künstlichem Meerwassermedium. Licht hemmt das Zellwachstum. Die wichtigsten zellulären Fettsäuren werden in Merkmal 9 (C17:1 ω9c und/oder 10-Methyl C16:0), 10-Methyl C18:0 und C16:0 zusammengefasst (Ergänzungstabelle 4). Die Gattung „Candidatus Lucifugimonas“ wird der SAR202-Gruppe Ia innerhalb der Klasse Dehalococcoidia zugeordnet, basierend auf der Phylogenie des 16S-rRNA-Gens und der Phylogenomik des gesamten Genoms. Die Typusart der Gattung ist „Candidatus Lucifugimonas Marina“.

Lucifugimonas Marina (ma.ri'na. L. fem. adj. marine, marine, des Meeres).

Zusätzlich zu den in der Gattungsbeschreibung angegebenen Eigenschaften wird die Art wie folgt beschrieben. Das Wachstum erfolgt bei Temperaturen zwischen 10 und 25 °C, jedoch nicht bei 4 °C oder darunter und auch nicht bei 30 °C oder darüber. Die optimale Wachstumstemperatur beträgt 15–20 °C. Wächst nur in flüssigem Medium auf Meerwasserbasis oder künstlichem Meerwassermedium. Das Zellwachstum wird durch Fucose, Fuconat, Fucono-1,4-lacton, Rhamnose, Rhamnono-1,4-lacton, Rhamnonat und Ascorbat gefördert. Der Typusstamm JH545 wurde aus epilagischem Meerwasser vor der Küste der Garorim-Bucht in Tea-An, Südkorea, isoliert. Die Länge der gesamten Genomsequenz des Typstamms beträgt 3,08 Mbp mit 51,8 % des DNA-G + C-Gehalts. Die GenBank-Zugangsnummer des Typstamms lautet CP046146. Neben dem Typstamm sind auch vollständige Genomsequenzen der zu dieser Art gehörenden Stämme JH639, JH702 und JH1073 unter den GenBank-Zugangsnummern WMBD00000000, WMBE00000000 bzw. CP046147 verfügbar.

Kandidat Lucifugimonadaceae (Lu.ci.fu.gi.mo.na.da.ce'ae. NL fem. n. Lucifugimonas, eine Bakteriengattung; -aceae, endend, um eine Familie zu bezeichnen; NL fem. pl. n. Lucifugimonadaceae, der Familie Lucifugimonas).

Die Beschreibung ist dieselbe wie bei der Gattung „Candidatus Lucifugimonas“. Die Typusgattung ist „Candidatus Lucifugimonas“. Entspricht GTDB f__UBA1328 (R207).

Kandidat Lucifugimonadales (Lu.ci.fu.gi.mo.na.da'les. NL fem. n. Lucifugimonas, eine Bakteriengattung; -ales, endend, um eine Familie zu bezeichnen; NL fem. pl. n. Lucifugimonadales, die Lucifugimonas Befehl).

Die Beschreibung ist dieselbe wie bei der Gattung „Candidatus Lucifugimonas“. Die Typusgattung ist „Candidatus Lucifugimonas“. Entspricht GTDB o__UBA1151 (R207).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle relevanten Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Papier und seinen ergänzenden Informations- und Datendateien verfügbar. Die in dieser Studie generierten 16S-rRNA-Gensequenzen von 24 Isolaten in SAR202-Gruppe I wurden in der GenBank-Datenbank unter den Zugangsnummern OQ689977 bis OQ690000 hinterlegt. Die gesamten in dieser Studie generierten Genomsequenzen sind in der GenBank-Datenbank unter den Zugangsnummern CP046146 (JH545), CP046147 (JH1073), WMBD00000000 (JH639) und WMBE00000000 (JH702) verfügbar. Die Genomdaten sind auch in der IMG/M-Datenbank unter den Genom-IDs 2901382945 (JH545), 2917498938 (JH1073), 2892960865 (JH639) und 2892963810 (JH702) verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Diese Forschung wurde durch das High Seas Bioresources Program des Korea Institute of Marine Science & Technology Promotion (KIMST) unterstützt, finanziert vom Ministerium für Ozeane und Fischerei (KIMST-20210646 an J.-CC) und Zuschüssen der National Research Foundation of Korea (NRF) ( NRF-2022R1A2C3008502, NRF-2018R1A5A1025077 und NRF-2021M3A9I4021431 an J.-CC; NRF-2022R1A6A3A01087360 an YL), finanziert vom koreanischen Ministerium für Wissenschaft und Informations- und Kommunikationstechnologie.

Abteilung für Biowissenschaften und Bioingenieurwesen, Inha-Universität, Incheon, 22212, Republik Korea

Yeonjung Lim, Ji-Hui Seo und Jang-Cheon Cho

Zentrum für Molekular- und Zellbiologie, Inha-Universität, Incheon, 22212, Republik Korea

Yeonjung Lim & Ilnam Kang

Abteilung für Mikrobiologie, Oregon State University, Corvallis, OR, 97331, USA

Stephen J. Giovannoni

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J.-HS und J.-CC planten und gestalteten das erste Isolationsprojekt. YL und J.-HS führten die Experimente durch. YL, J.-HS und IK analysierten die Daten. YL, IK, SJG und J.-CC haben das Manuskript geschrieben und überarbeitet. IK und J.-CC betreuten das Projekt.

Korrespondenz mit Ilnam Kang oder Jang-Cheon Cho.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Brett Baker und Yusuke Okazaki für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Lim, Y, Seo, JH, Giovannoni, SJ et al. Kultur mariner Bakterien der SAR202-Klade. Nat Commun 14, 5098 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40726-8

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Eingegangen: 4. April 2023

Angenommen: 07. August 2023

Veröffentlicht: 22. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40726-8

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